transfection of ram spermatozoa with pegfp carrying human lysozyme gene

[ ' b a c k g r o u n d : a s w e a l l k n o w ' , ' s p e r m h a s t h e c a p a c i t y t o t a k e u p f o r e i g n d n a ' , ' t h e r e f o r e ' , ' s p e r m m e d i a t e d g e n t r a n s f e r c a n b e a n i n e x p e n s i v e a n d s i m p l e m e t h o d i n a n i m a l t r a n s g e n e s i s i n v a r i o u s s p e c i e s . h o w e v e r ' , ' t h e r e i s n o t s u f f i c i e n t e v i d e n c e o f d n a u p t a k e b y o v i n e s p e r m a t o z o a . o b j e c t i v e s : t h e p u r p o s e o f t h e p r e s e n t s t u d y w a s t o e x a m i n e t h e u p t a k e o f h u m a n l y s o z y m e g e n e c o n t a i n e d p l a s m i d ( p e g f p ' , ' i r e s ' , ' h l y s ) b y o v i n s p e r m a t o z o a . m e t h o d s : i n t h e f i r s t e x p e r i m e n t ' , ' s e m e n w a s p r e p a r e d f r o m t h r e e r a m ( e a c h r a m t w o t i m e s ) b y e l e c t r i c a l m e t h o d . a f t e r r e m o v a l o f s e m i n a l p l a s m a ' , ' 1 x 1 0 6 s p e r m a t o z o a w e r e i n c u b a t e d w i t h r h o d a m i n ' , ' l a b l e d p e g f p ' , ' i r e s ' , ' h l y s i n t c m 1 9 9 f o r 1 5 ' , 3 0 , ' 6 0 a n d 1 2 0 m i n u t e s a n d t h e n o b s e r v e d f o r m o t i l i t y ' , ' u p t a k e p e r c e n t a n d u p t a k e i n t e n s i t y b y f l o r e s c e n t m i c r o s c o p y . a l s o a f t e r 6 0 m i n u t e s i n c u b a t i o n s p e r m s w e r e t r e a t e d b y d n a s e i t o a s s a y a d s o r p t i o n o r u p t a k e o f p e g f p ' , ' i r e s ' , ' h l y s . i n t h e s e c o n d e x p e r i m e n t ' , ' w a s h e d a n d u n w a s h e d s p e r m s w e r e i n c u b a t e d w i t h r h o d a m i n ' , ' l a b l e d p e g f p ' , ' i r e s ' , ' h l y s i n t c m 1 9 9 f o r 3 0 a n d 6 0 m i n u t e s t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f p r e s e n c e s e m i n a l p l a s m a o n s p e r m u p t a k e a n d m o t i l i t y . r e s u l t s : t h e f i n d i n g s s h o w e d t h a t i n c r e a s i n g i n c u b a t i o n t i m e i n c r e a s e d n u m b e r / p e r c e n t a g e o f s p e r m a t o z o a c a r r y i n g e x o g e n o u s d n a a n d i t s i n t e n s i t y . b u t t h i s d i f f e r e n t w a s s i g n i f i c a n t o n l y u p t o 3 0 m i n u t e s . w e f o u n d t h a t 6 0 . 1 6 % o f t h e c e l l s w e r e b o u n d t o d n a a f t e r 1 2 0 m i n u t e s i n c u b a t i o n . i n c u b a t i o n w i t h e x o g e n o u s d n a i n d u c e d a s l i g h t l y d e c r e a s e i n s p e r m t o t a l a n d p r o g r e s s i v e m o t i l i t y . b u t n o p o s t a c r o s o m u p t a k e d s p e r m w a s m o t i l e . a f t e r t r e a t m e n t w i t h d n a s e i ' , ' s t r o n g f l o r e s c e n t e m i s s i o n f r o m p o s t a c r o s o m i n d i c a t e d a b s o r p t i o n o f p e g f p ' , ' i r e s ' , ' h l y s b y s p e r m a t o z o a . p r e s e n c e o f s e m i n a l p l a s m a i n d u c e d a s l i g h t l y d e c r e a s e i n p e r c e n t o f d n a a b s o r b e d s p e r m a t o z o a a n d a b s o r p t i o n i n t e n s i t y ' , ' b u t d i d n o t i n h i b i t c o m p l e t e l y . c o n c l u s i o n s : r a m s p e r m a t o z o a s h o w e d a h i g h c a p a c i t y t o b i n d d n a q u i c k l y a n d r e a c h a m a x i m u m a f t e r 3 0 m i n . h o w e v e r ' , ' n o s p e r m w i t h r e a l u p t a k e ( p o s t a c r o s o m a l ) w a s m o t i l e . i n c u b a t i o n w i t h l o w e r d n a c o n c e n t r a t i o n a n d / o r s h o r t e r t i m e m a y b e h e l p f u l . ' ]